style="width:1.73995in;height:0.70664in" /> ……………… ……… (B.3) 本文是学习GB-T 34748-2017 水产种质资源基因组DNA的微卫星分析. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了水产种质资源基因组 DNA
的微卫星分析的试剂与材料、仪器与设备、分析步骤及数
据分析。
本标准适用于水产种质资源基因组 DNA 的微卫星分析。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18654.15 养殖鱼类种质检验 第15部分：RAPD 分析
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
微 卫 星 microsatellite
真核生物基因组中由两个或多个核苷酸重复排列形成的短串联重复序列。
3.2
微卫星分析 microsatellite analysis
用微卫星标记引物对基因组 DNA
进行扩增，扩增产物经凝胶电泳检测后，分析电泳图谱并计算其
中蕴涵的遗传多态性信息。
除 GB/T18654.15
规定的试剂与材料外，以下试剂和材料是本标准所需的。除非另有说明，在分
析中仅使用确认为分析纯的试剂和双蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
4.2 TEMED: 于4 ℃冰箱中保存。
4.3 微卫星标记引物：配制方法符合附录 A。
4.5 甲叉双丙烯酰胺：DNA 测序级。
4.8 聚丙烯酰胺凝胶存储液：配制方法符合附录 A。
4.9 10%(质量体积比)过硫酸铵(APS) 溶液：配制方法符合附录 A。
4.10 聚丙烯酰胺凝胶固定液：配制方法符合附录 A。
4.11 聚丙烯酰胺凝胶染色液：配制方法符合附录 A。
GB/T 34748—2017
4.12 聚丙烯酰胺凝胶显色液：配制方法符合附录 A。
4.13 电泳载样液：配制方法符合附录 A。
4.14 基因组 DNA 提取试剂盒：从生物试剂供应商处购买。
4.15 1×Tris EDTA(TE):配制方法符合附录 A。
除 GB/T18654.15 规定的仪器与设备外，以下仪器与设备是本标准所需的。
试验生物抽样按照 GB/T 18654.15 的规定执行，样本量宜40个以上。
可用基因组DNA 提取试剂盒或已被验证可以抽提到高质量基因组DNA
的方法或按GB/T 18654.15
的规定提取基因组 DNA。 若用基因组DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA
按说明书操作。
7.2 基因组 DNA 纯度及浓度测定
按GB/T 18654.15 的规定执行。
从受检测物种或近缘种中筛选出扩增稳定、重复性好且具有多态性的微卫星标记用于基因组
DNA
的微卫星分析。微卫星标记应遵循哈代温博格平衡，微卫星标记所含等位基因数宜在4个以上，微卫星
标记数量应遵循标记数量增加而有效等位基因、期望杂合度、多态性信息含量等不发生显著变化时最少
标记的数量， 一般为25个～30个。
7.4 基因组 DNA 的 PCR 扩增
根据7.2基因组 DNA 纯度和浓度测定结果，取部分 DNA
用灭菌的超纯水稀释至50 ng/μL,于
4℃中保存备用，其余放一20 ℃冰箱中保存。
根据7.3的原则选择微卫星标记，将合成的引物配制成100 μmol/μL
的保存液，于-20℃冰箱中
保存备用。使用时取部分保存液，配制成10μmol/μL使用液，也可按所需倍数稀释后使用，保存液仍
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放回-20℃冰箱中保存。
按照 GB/T 18654.15 的规定执行。
按下列程序进行扩增：第一个程序94℃预变性3 min～10 min 后，第二个程序94℃
30 s,退火 30 s(根据不同引物的退火温度设定),72℃30 s,20
个～38个循环，第三个程序72℃延伸5 min~
10 min。 可根据具体反应调节 PCR 程序，使扩增效果达到最优。
扩增产物直接电泳或于4℃暂时保存(一般不超过6
h)至电泳。如需长时间保存，可在一20 ℃冰
箱中保存。
使用非变性聚丙烯酰胺凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶进行 PCR
产物凝胶电泳检测，或用自动测序仪
或遗传分析仪进行 PCR 产物检测。
7.5.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
7.5.2.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶制备
将胶模玻璃板清洗干净，自然晾干后根据电泳槽设备说明书安装胶模。
根据检测 PCR 产物大小的范围，选择合适的非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度，
一般使用6%～12%浓 度的凝胶。量取适量聚丙烯酰胺凝胶存储液，加入 TBE
缓冲液，用去离子水定容至所需体积，使 TBE
缓冲液终浓度为1×。每毫升加入7μL10% APS溶液和1μLTEMED,
搅拌均匀后，迅速灌胶，插入
梳子，在灌胶及插入梳子时注意不要产生气泡。于室温放置30 min～60
min,待凝胶完全凝固后进行
预电泳。
7.5.2.2 电泳样品的准备
取 PCR 产物10μL,加入2μL～5μL 电泳载样液，混匀，放于4℃备用，其余的PCR
产物放于-20℃
中保存，以备复查。
7.5.2.3 电泳
将凝固好的非变性聚丙烯酰胺凝胶装入垂直电泳槽中，倒入1×TBE
电泳缓冲液，清洗加样孔，220 V 恒压4℃~10℃下预电泳30 min。
之后关闭电泳仪电源，取1μL～8μL 电泳样品上样到凝胶的样品孔
中，样品孔的两边和凝胶中间各加一个DNA
MARKER作为计算分子量的标准样，在1V/cm～8V/cm 恒
压4℃~10 ℃下电泳。
在电泳载样液中的指示剂到达合适的位置时，关闭电泳仪。
7.5.2.4 染色
聚丙烯酰胺凝胶一般采用银染，在染色的各步骤操作中，凝胶均应置于水平转动摇床上使之缓慢
摇动。
固定：将凝胶从玻璃板的胶模中取出，用蒸馏水冲洗2次～3次，放入盛有固定液的盘中浸泡
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染色：倒掉固定液，用去离子水冲洗凝胶3次，每次5 min,倒入染色液，浸泡10
min～30 min。
显色：染色结束后，将染色液倒入回收瓶中(可重复使用1次～2次)。凝胶用去离子水冲洗3次~
5次，倒入预冷的显色液，浸泡2 min～5 min。
当出现明显的条带后倒掉显色液，用去离子水冲洗2次~
3次，即可进行成像拍照。
7.5.2.5 成像
利用扫描仪或光密度扫描仪扫描凝胶成像，或用数码相机进行拍照，记录图像和处理信息。成像后
可将凝胶制成干胶保存，以备建档和复查。
7.5.3.1 变性聚丙烯酰胺凝胶制备
将胶模玻璃板清洗干净，自然晾干后根据电泳槽设备说明书安装胶模。
根据检测PCR 产物大小的范围，选择合适的变性聚丙烯酰胺凝胶浓度，
一般使用4%～12%浓度 的凝胶。量取适量聚丙烯酰胺凝胶存储液，加入 TBE
缓冲液，和质量体积比为42%的尿素，也可根据
需要加入体积比为25%或40%的去离子甲酰胺，用去离子水定容至所需体积，使TBE
缓冲液终浓度为 1×。每毫升加入7μL10% APS溶液和1μLTEMED,
搅拌均匀后，迅速灌胶，插入梳子，在灌胶及插
入梳子时注意不要产生气泡。于室温放置2 h
以上，待凝胶完全凝固后进行预电泳。
7.5.3.2 电泳样品的准备
取PCR 产物2μL～5μL, 按 PCR
产物和去离子甲酰胺载样液比例为1:1～1:5的体积比加入适
量的去离子甲酰胺电泳载样液，混匀，在95℃下变性10 min,迅速放入冰水中冷却10
min 后立即加样。
其余的 PCR 产物放于-20 ℃中保存，以备复查。
7.5.3.3 电泳
将凝固好的变性聚丙烯酰胺凝胶装入垂直电泳槽中，倒入1×TBE
电泳缓冲液，清洗加样孔，30 W~
80W 恒功率下预电泳30
min,使凝胶温度上升至45℃~50℃。之后关闭电泳仪电源，再次清洗加样
孔，取3μL～8μL
样品上样到凝胶的样品孔中，样品孔的两边和凝胶中间各加一个DNA MARKER 作
为计算分子量的标准样。在30 W～80 W恒功率下电泳，保持凝胶温度在45℃~50℃。
7.5.3.4 染色
7.5.2.4 的规定执行。
7.5.3.5 成像
7.5.2.5 的规定执行。
7.5.4 自动测序仪或遗传分析仪基因分型分析
利用自动测序仪或遗传分析仪进行 PCR
产物基因型检测，具体操作按自动测序仪或遗传分析仪操
作手册或说明书执行。
采用图谱分析软件分析电泳图谱，根据分子量标准计算出每条扩增条带的大小，确定每个引物扩增
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的等位基因数和样本的基因型，进行遗传参数的计算(符合附录 B)。
对实验设计、方法、步骤、电泳图谱、分析结果等建立详细的档案(参见附录C)。
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(规范性附录)
基因组 DNA 微卫星分析试验溶液的配制
A.1 微卫星标记引物
微卫星标记引物合成后，每 OD 加入适量体积的灭菌1×TE 溶解，配制成100
μmol/L 的母液，放 于-20℃中保存备用。或采用自动测序仪或遗传分析仪进行 PCR
产物基因型分析，则合成引物时需
按照自动测序仪或遗传分析仪的要求在5'末端进行荧光或其他标记物的修饰，若进行荧光修饰，则需
避光保存。
A.2 聚丙烯酰胺凝胶存储液
丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按照一定的交联度配制成质量浓度比为30%或45%或其他浓度的储
存液，需用孔径为0.45 μm
的硝酸纤维素膜过滤。或直接购买预先混合好的丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰
胺溶液或粉末，若为粉末，则按浓度比用去离子水直接溶解即可。
45%的聚丙烯酰胺凝胶存储液配制为：丙烯酰胺434 g,甲叉双丙烯酰胺16
g,加入离子水600 mL 后加热至37℃溶解，冷却至室温后用去离子水定容至1 L,
用孔径为0.45μm 的硝酸纤维素膜过滤，室
温存储于棕色瓶中。
A.3 10% (质量体积比)过硫酸铵(APS) 溶液
称取0.1 g 过硫酸铵放入1.5 mL 离心管中，加入1 mL
去离子超纯水，震动，充分溶解，于4℃保存
备用， 一般现配现用。
A.4 聚丙烯酰胺凝胶固定液
体积比为10%乙醇和0.5%冰醋酸的混合液。配制500 mL 固定液，量取50 mL
乙醇，2.5 mL 冰乙
酸，然后用去离子超纯水定容至500 mL。 也可根据各自实验室的经验配制。
A.5 聚丙烯酰胺凝胶染色液
0.1%(质量体积比)硝酸银：称取0.5 g 硝酸银，400 mL
去离子超纯水充分溶解后，定容至500 mL, 于
棕色瓶于常温下密闭放置，可以重复使用2次～3次。也可根据各自实验室的经验配制。
A.6 聚丙烯酰胺凝胶显色液
配制500 mL 显色液：称取10 gNaOH,0.2g NaHCO₃ ,加入400 mL
去离子超纯水，充分溶解后，
加入5 mL 甲醛溶液，定容至500 mL。
显色液一般现配现用，配制好后放入-20℃冰箱中预冷30 min,
若有未使用的显色液，放入4℃冰箱中保存，以供下次使用。也可根据各自实验室的经验配制。
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A.7 电泳载样液
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳一般使用蔗糖溴酚蓝溶液或者购买 Taq DNA
聚合酶时自带的载样
液，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用去离子甲酰胺变性载样液。
蔗糖溴酚蓝溶液配制如下：0.25%溴酚蓝，40%(质量浓度)蔗糖，充分溶解后，过滤，分装4℃保存
备用。
去离子甲酰胺变性载样液配方如下：
98%
0.25%
0.25%
去离子甲酰胺(体积比)
EDTA(pH 8.0)
溴酚蓝
二甲苯氰
49 mL(100% 去离子甲酰胺溶液)
1 mL(0.5 mol/L EDTA pH 8.0) 0.125 g
A.8 1×Tris EDTA(TE)
1 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris-Cl溶液，调节 pH 值至7.5。
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(规范性附录)
微卫星分析相关遗传参数计算公式
微卫星电泳图谱经过软件分析后，得到各等位基因大小，及每个个体扩增的等位基因，以此获得个
体的基因型数据。采用基因型数据分析软件或手工计算出每个位点各等位基因的基因频率、等位基因
数量、有效等位基因数量、预测杂合度、期望杂合度、多态性信息含量及位点的哈代温博格平衡检验。以
下公式假设群体共有 N 个个体的样品，每个座位检测出了m 个等位基因。
B. 1 基因频率(P):
P;=(2N;+N;)/2N … … … … … … … … … …(B. 1)
式 中 ：
P;— 第 i 个等位基因的基因频率；
N;—— 含有第 i 个等位基因的纯合个体数；
N,—— 含有第 i 个等位基因的杂合个体数；
N— 总个体数。
B.2 观测等位基因数(A 。):
A 。=m … … … … … … … … … …(B.2)
式 中 ：
A 。—— 观测等位基因数；
m — 检测出的等位基因数。
B.3 有效等位基因数(A 。):
style="width:1.73995in;height:0.70664in" /> ……………… ……… (B.3)
式 中 ：
A 。—— 有效等位基因数；
m — 等位基因数量；
P,-- 第 i 个等位基因的频率，按式(B. 1) 计算。
B.4 观测杂合度(h 。):
h 。=HN/N … … … … … … … … … …(B.4)
式 中 ：
h 。— 观测杂合度；
HN—- 某 一位点上含有杂合基因型的个体数；
N — 个体数。
B.5 期望杂合度(h 。):
style="width:1.8666in;height:0.68002in" /> … … … … … … … … … …(B.5)
式 中 ：
h。— 期望杂合度；
m ——等位基因数量；
P;—- 第 i 个等位基因的频率，按式(B.1) 计 算 。
B.6 多态性信息含量(PIC):
style="width:4.08658in;height:0.72006in" /> … … … … … … … … … …(B.6)
GB/T 34748—2017
式中：
PIC—— 多态性信息含量；
m —— 等位基因数量；
P:- 第 i 个等位基因的频率，按式(B. 1) 计算。
B.7 哈代温博格平衡：
HWE=∑(O-E)²/E … … … … … … … … … …(B.7)
式中：
HWE—— 哈代温博格平衡卡方检验值，HWE
符合自由度为基因型数量减去等位基因数量的卡方
检验；
O —— 基因型在群体中的观测值；
E —— 基因型在群体中的期望值。
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(资料性附录)
水产生物基因组 DNA 的微卫星分析记录表
C.1 分析样品的基本信息
见表C.1。
表 C.1 分析样品的基本信息
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C.2 样品基因组 DNA 纯度及含量
见表C.2。
表 C.2 基因组 DNA 纯度及浓度
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C.3 微卫星引物序列信息
见表C.3。
GB/T 34748—2017
表 C.3 微卫星引物及扩增信息
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C.4 扩增图谱分析结果(0/1 矩阵)
见 表 C.4。
表 C.4 微卫星分析结果
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C.5 微卫星分析结果
见 表 C.5。
表 C.5 微卫星分析结果
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